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基因扩增PCR的扩增与克隆方法及一些使用的小建议

点击次数:393 发布时间:2020-11-24

 基因扩增PCR主要有冰箱、超净台、加样器、混匀器、天平等。加样器、天平除了要外,还应有定期校准。试剂分装应在超净台中进行,扩增反应混合液应使用分子生物学级的,试剂制备好后应有质检:一是否有污染、二是检测试剂的扩增效果。

 

  基因扩增PCR的扩增与克隆方法:

  ①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区,且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合,提高反应的特异性

 

  ②引物长度:15-40bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。

 

  ③引物的碱基尽可能随机发布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,G+C碱基的含量在40%-75%之间。

 

  ④引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的末端应避免有回文结构。

 

  ⑤二个引物不应有互补序列,特别是3’端应避免互补,以免形成“引物二聚体”,浪费引物。

 

  ⑥引物5’末端碱基无严格限制,在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下,其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态,因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等,引物的5’端至多可加10个碱基而对PCR反应无影响。

  基因扩增PCR的使用建议:

  1、使用本制品时务必将Buffer反复混匀后再加,避免因组分不一导致结果差异;

 

  2、配置和分装反应液时请一定使用新的(无污染的)喷头以避免污染;

 

  3、如扩增条带多,可适当添加酶和dNTPs;

 

  4、当多重PCR扩增产物的长度均在1kb以内时,使用3%~4%浓度的Agarosegel进行电泳分离效果。

 

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